实验教学中心
生化实验
宣布时间：2022-10-10 作者： 点击：[] 分享到：
实验室宁静教育
一、实验目的
1.
了解实验室宁静治理制度
2.
主要掌握化学品使用、危险废物处置和应抢救援
二、实验室典型宁静隐患及宁静教育案例
1.
试剂瓶放在桌面边缘
2.
做完实验盖子不实时盖好拧紧
3.
废液桶与废弃物存放点无警戒标识
4.
典型事故、事例
8
·
12
天津滨海新区爆炸事故——高校实验室宁静治理的分水岭；
2015
年
8
月
12
日，天津市滨海新区发生火灾爆炸事故造成
165
人遇难 、
8
人失踪，
798
人受伤 ，造成直接经济损失
68.66
亿元。瑞海公司集装箱内的硝化棉在高温等
因素的作用下自燃， 引起相邻集装箱内的硝酸铵等危险化学品发生爆炸。
8
月
14
日国务院紧急出台《关于深入开展危险化学品和易燃易爆物品宁静专
项整治的紧急通知》
三、一般宁静
1.
应熟悉实验室情况： 水、 电阀门以及宁静通道的位置。 熟悉种种灭火和
应急设备的位置和使用要领。
2.
开展实验时要密切关注实验进展情况， 不得擅自离岗，进行危险实验时至
少
2
人在场。 严禁将实验室内任何物品私自带出实验室。
3.
实验结束后， 最后一个离开实验室的人员必须检查并关闭整个实验室的
水、 电、 气、 门窗。
4.
进入实验室要做好须要的小我私家防护， 不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。
5.
严禁穿着实验室防护服离开实验室， 如就餐或去办公室、休息室和卫生间
等。
6.
禁止在实验室事情区域进食、 饮水、 吸烟、 化妆和处置惩罚隐形眼镜。
7.
禁止在实验室储存食品和饮料。
8.
处置惩罚熏染性实验质料和动物后， 以及离开实验室前都应洗手。
9.
实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。
四、消防宁静
1.实验室火灾隐患
1)
加热设备引起火灾
2)
违反操作规程引起火灾
不规范的蒸馏、 回流等操作
3)
易燃易爆危险品引起火灾
4)
化学废弃物易引起火灾
5)
用电不规范或电路老化引起火灾
6)
违规吸烟， 乱扔烟头引起火灾
2.
火灾初起的紧急处置惩罚
3.
消防器材使用要领
4.
火场自救与逃生知识
生命宁静最重要 ！
五、化学品宁静
1.
危险化学品是指具有迫害、腐蚀、爆炸、燃烧、助燃等性质，对人体、环
境具有危害的剧毒化学品和其他化学品。
2.
采购受公安机关管控， 应通过院系申请、 学校等相关部门审批， 由治理
人员登录“危险化学品治安治理信息系统”
进行网上存案，
获得公安机关审批
后， 统一采购。
3.
化学品生存的一般原则：保持整洁、
通风、
隔热、
宁静，
远离热源、
火
源、 电源和水源， 制止阳光直射。
4.
危险品分类存放要求 ：如还原剂、 有机物等不能与氧化剂、硫酸、 硝酸
混放；
5.
强酸不能与强氧化剂的盐类混放；
6.
遇酸可发生有害气体的盐类（如： 氰化钾等）不能与酸混放。
六、化学品使用规范
1.
进行实验之前应先阅读使用化学品的宁静技术说明书，了解化学品特性、
影响因素与正确处置惩罚事故的要领，接纳须要的防护措施。
2.
实验人员穿着适合的实验事情服，长衣长裤，不得穿短裤短裙以及露趾凉鞋。
3.
严格按实验规程进行操作，在能够到达实验目的和效果的前提下，尽量淘汰
药品用量，或者用危险性低的药品替代危险性高的药品。
4.
不行直接接触药品、品尝药品味道、把鼻子凑到容器口嗅闻药品的气味。
5.
使用剧毒化学品、 爆炸性物品或强挥发性、 刺激性、 恶臭化学品时， 应
在通风良好的条件下进行。
七、危险废物处置
:
1.
破损的玻璃仪器（试管、量筒、烧杯等）应专门存放，不得与实验垃圾混放。
2.
废试剂瓶倒尽残液后应使用专用纸箱包装存放。
3.
化学实验废液不得直接倒入下水道。液桶盛放不得凌驾最大容量的
80%
。收
集废液后应随时盖紧盖子（含内盖），存放位置要阴凉并远离热源、 火源。
4.
运送实验废物时，
至少需两人同行，
并穿着实验服，
佩戴口罩和手套，
做
好防护。 配合治理人员检查并称重， 填写入库纪录， 粘贴危险废物标签。
八、应抢救援：
发生化学宁静事故， 应立即陈诉老师， 并积极接纳措施进行应抢救援， 然
后送医院治疗。
1.
化学烧灼伤
应立即脱去沾染化学品的衣物，迅速用大量清水长时间冲洗，制止扩大烧伤
面。处置惩罚时，应尽可能保持水疱皮的完整性，不要撕去受损的皮肤。
2.
化学冻伤
应迅速脱离低温情况和冰冻物体，用
40
℃左右温水将冰冻融化后将衣物脱
下或剪开，然后对冻伤部位进行复温，并尽快就医。
3.
吸入化学品中毒
坚决措施切断毒源，并打开门、
窗，
降低毒物浓度。迅速将伤员救离现场，
搬至空气新鲜、 流通的地方，松开领口、 紧身衣服和腰带， 以利呼吸畅
通， 使毒物尽快排出。
.
上学期实验：
实验一 卵白质浓度的测定(1)—— Folin-酚法
一、实验目的
1.
学习
Folin-
酚试剂法测定卵白质含量的原理及要领
2.
学习绘制尺度曲线
3.
掌握用尺度曲线求待测物质含量的要领
二、实验原理
1921 年，Folin 首创，利用卵白质分子中酪氨酸残基（酚基）还原酚试剂
（磷钨酸
-
磷钼酸）起蓝色反映。
1951
年，
Lowry
对此法进行了革新，先在标本
中加碱性铜试剂，再与酚试剂反映，提高了灵敏度。
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合
物还原而呈蓝色反映(钼蓝和钨蓝的混淆物)。由于卵白质中含有带酚羟基的酪
氨酸(Tyr) ，故有此显色反映。该反映分两步进行，首先在碱性溶液中，卵白质
分子中的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+作用生成紫红色的卵白质- Cu2+复合物，然
后，卵白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，
生成蓝色的化合物。
在一定浓度规模内，蓝色的深浅度与卵白质浓度呈线性关系，故可凭据预先
绘制的尺度曲线求出未知样品中卵白质的含量。
三、实验试剂及仪器
1. 实验试剂
（
1
） 待测样品
（
2
） 酪卵白尺度品
（
3
）
Folin-
酚试剂甲：
（
4
）
Folin-
酚试剂乙：
（
5
）酪卵白尺度溶液母液（
500
μ
g/ml
）：
2. 实验仪器
（
1）722N 型可见分光光度计
（
2）试管 7 支、试管架
（
3）移液枪
（
4）水浴锅
四、实验步骤
1
、尺度曲线的绘制：
取六支洁净试管编号，按下表加入试剂：（单元毫升）
2.
待测样品：
准确吸取待测样液
0.5ml
于
7
号试管内，加入蒸馏水
0.5ml
、
Folin-
试剂甲
5.0ml
、
Folin-
试剂乙
0.5ml
，重复上步操作，测样品
A500
。
五
、
实验结果与分析
1.
尺度曲线绘制
C
X
：为凭据待测样品的吸光值查尺度曲线所得的卵白质浓度
编号
(
尺度溶液
浓度
)
酪卵白尺度
溶液母液
(500
μ
g/ml)
ml
去离子水
(ml)
Folin-
酚甲
(ml)
Folin-
酚乙
(ml)
A500
1
0.0
1.0
5.0
0.5
0.000
2
0.2
0.8
5.0
0.5
X.XXX
3
0.4
0.6
5.0
0.5
X.XXX
4
0.6
0.4
5.0
0.5
X.XXX
5
0.8
0.2
5.0
0.5
X.XXX
6
1.0
0.0
5.0
0.5
X.XXX
7(?)
待测样液
0.5ml
0.5
5.0
0.5
X.XXX2.
盘算待测样品浓度
凭据图中数值，盘算出待测样品的浓度。
六、实验注意事项
（一）实验操作注意事项
1. Folin-
酚乙试剂在碱性条件下不稳定，当
Folin-
酚试剂加到碱性的铜
-
卵白质溶
液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反映发生在磷钼酸
-
磷钨
酸试剂被破坏之前
;
2.
尽量淘汰各管之间的反映时间误差；
3.
一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不停增大的，如
果时间凌驾了
30
分钟，则测得的光密度值就禁绝确了；
4.
在使用分光光度计时，拿比色皿是要拿它的毛面，不行以用手接触它的平滑
面，防止自己手上的油污是丈量值禁绝确；
5.
在擦拭比色皿时，要顺着一个偏向擦；
6.
在比色皿中装入的液体量约莫要是比色皿体积的三分之二
.
（二）尺度曲线制作注意事项
1.
作一条尺度曲线至少要
5
个点
2.
被测物与尺度物应在相同条件下测定
3.
尽量使未经过线上的实验点均匀漫衍在曲线或直线两侧
4.
尺度曲线中尺度物浓度有一定的线性规模，应使尺度曲线规模在被测物质浓
度的
1/2
～
2
倍之间，并使吸光度在
0.05
～
1.0
规模为宜
（三）移液枪使用注意事项
1.
量程选择：
35%-100%
规模内最佳
2.
概略积→小体积
顺时针
;
小体积→概略积 逆时针
3.
将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可
4.
吸液
:
垂直吸液，枪头尖端需浸入液面
2-4mm
以下。慢吸慢放，控制好弹
簧的伸缩速度。吸液速度太快会发生反冲和气泡，导致移液体积禁绝确。
5.
放液
:
将吸嘴口贴到容器内壁并保持
10-40
°倾斜。平稳地把按钮压到一档，
停约一秒钟后压到二档，排出剩余液体。压住按钮，同时提起移液枪
;
松开
按钮。 按弹射器除去移液嘴。
6.
使用完毕
:
至最大量程
,
让弹簧恢回复形，挂至移液枪架上。
七、思考题
1.
试述
Folin-
酚试剂法的优点？
2.
应用本要领有哪些滋扰作用？为什么？应如何注意？
3.
什么叫尺度曲线？ 绘制尺度曲线有何实用意义？
实验二 卵白质浓度测定(2)-紫外线（UV）吸收法
一、实验目的
1.
学习紫外线（
UV
）吸收法测定卵白质含量的原理
2.
了解紫外分光光度计的结构原理
3.
掌握它的使用要领。
二、实验原理
由于卵白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此卵白质具
有吸收紫外线的性质，吸收岑岭在
280nm
波优点。在此波长规模内，卵白质溶
液的光吸收值（
A280
）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外线吸收法测定卵白质含量的优点是迅速、轻便、不用耗样品，低浓
度盐类不滋扰测定。因此，在卵白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析疏散中）
广泛应用。
此法的缺点是：（
1
）对于测定那些与尺度卵白质中酪氨酸和色氨酸含量差
异较大的卵白质，有一定的误差；（
2
）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的
物质，会泛起较大的滋扰。 差异的卵白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即
使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为开端定量的依据。
三、实验试剂及仪器
1. 实验试剂
（
1
）尺度卵白质溶液（
1mg/ml
）
（
2
）待测卵白质溶液，浓度需稀释至
1mg/ml
四周。
2. 实验仪器
紫外分光光度计、微量移液器、枪头、试管和试管架等
四、实验步骤
1.
尺度曲线法：
取
8
支试管，按下表加入试剂（单元
ml
），并进行操作，绘制尺度曲线，
A280
值为纵坐标，卵白质浓度为横坐标（卵白质浓度为
mg/ml
）。
2.
取待测卵白质溶液
2.0 ml
于
5
号试管中
,
加入蒸馏水
2.0 ml
，摇匀，按上述方
法测定
A280
，在尺度曲线上查出待测卵白质浓度。
五
、
实验结果与分析
1
． 原始数据
:
纪录各管的
OD
值
2
． 绘制出尺度曲线：要求规范作图
（
1
）用铅笔作图、
（
2
）标出横、纵坐标名称及单元
（
3
）标出日期、作者 、曲线名称
（
4
）曲线上体现出待测样品的
OD
值及浓度值。
3.
盘算：卵白质含量。
（
1
）要求： 写出公式、代入数据、写出结果。
(2
）凭据尺度曲线
R
2
值判断实验结果是否可靠，分析可能造成实验误差
的原因有哪些？
六、实验注意事项
1.
比色皿使用时注意不要沾污或将比色皿的透光面磨损，应手持比色皿的毛
面。
2.
待测液制备好后应尽快丈量，制止有色物质剖析，影响丈量结果。
3.
测得的吸光度
A
最好控制在
0.2~0.8
之间，凌驾
1.0
时要做适当稀释。
4.
开关试样室盖时行动要轻缓。
5.
不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器外貌，损坏仪器。
6.
比色皿在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，丈量结束后比色皿应用
蒸馏水清洗洁净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡
清洗。
七、思考题
1.
紫外吸收法与
Folin-
酚比色法测定卵白质含量相比，有何缺点及优点？
2.
若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？
3.
分析实验误差发生的原因
4.
为什么吸光度
A
最好控制在
0.2~0.8
之间？
实验三 血清卵白醋酸纤维素薄膜电泳
一、实验目的
1.
了解电泳的一般原理
2.
掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术
3.
掌握醋酸纤维薄膜电泳疏散血清卵白的要领
二、实验原理
血清中种种卵白质的等电点差异，一般都低于
pH7.4
。它们在
pH8.6
的缓冲
液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
血清中含有清卵白，
α
-
球卵白、
β
-
球卵白、
γ
-
球卵白和种种脂卵白等，种种卵白质由于氨基酸组分、立体构
象、分子巨细、形状及所带的电荷量差异，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速
度也差异，因此可以将它们疏散。
在相同碱性
PH
值缓冲体系中，
分子量小、
等电点低、带负荷电荷多的卵白质颗粒在电场中迁移速度较快。
醋酸纤维素薄膜电泳是接纳醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳要领。
醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，该膜具有均一的泡
沫状结构，厚度约为
120
μ
m
，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的
电泳支持物。具有微量、快速、轻便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和生存
等优点。常用于科学实验、生化产物分析和临床化验，如血浆卵白、血红卵白、
球卵白、脂卵白、糖卵白、甲胎卵白、同工酶等的疏散判定。
三、实验试剂及仪器
1.
实验试剂、质料
巴比妥
-
巴比妥钠缓冲溶液，染色液，漂洗液，血清
:
医院采血
2.
实验仪器
常压电泳仪、水平电泳槽、点样器、滤纸、醋酸纤维素薄膜、培养皿、镊子等
四、实验步骤
1.
准备和点样 ：
将醋酸纤维素薄膜（
2cm
×
8cm
）浸入缓冲溶液中，待完全浸透用镊子轻轻取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后将无光泽面朝上平放于滤纸
上。点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在加样线上，使血清成一条状点
于醋酸纤维素薄膜一端
1.5
厘米处，将薄膜无光泽面朝下，点样端为阴极，进
行电泳。
2.
电泳条件：
电压
80-90V
，恒压，
1h
，电流与薄膜几多相关。
3.
染色、漂洗：
电泳完毕，将薄膜浸于染色液中
10
分钟，取出，置漂洗液中漂洗
2-3
次至
配景无色，再浸于蒸馏水中视察。
五
、
实验结果与分析
以醋酸纤维素薄膜为支持物，正凡人血清在
PH8.6
的缓冲体系中电泳
1h
左
右，染色后可显示
5
条区带。清卵白泳动最快，其余依次为
α
1-
、
α
2-
、
β
-
及
γ
-
球卵白，如下图所示。
对照各自电泳结果，分析各将条带是否乐成疏散，存在的问题及原因有哪些？
六、实验注意事项
1 .
薄膜的浸润与选膜是电泳成败的要害之一。
2.
应将薄膜外貌多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。
3.
分清薄膜的点样面，点样应点在薄膜的毛面上。
4.
点样要细窄、均匀、集中；点样量要适量，不宜过多或过少； 行动要轻、
稳，用力不能太大。
5.
注意薄膜放置的偏向。电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且
点样面向下。
6.
勿使点样处与电泳槽接触。
7.
应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，
或造成条带染色不均匀，须要时可进行复染。
七、思考题
1
．电泳时，点样端置于电场的正极照旧负极？为什么？
2
．电泳后，泳动在最前面的是何种卵白质？各谱带为何种身分？请分析原因。
3 .
电泳图谱清晰的要害是什么？如何正确操作？
实验四 维生素 C 的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法 ）
一、实验目的
1.
学习用
2,6
—二氯酚靛酚滴定法测定维生素
C
含量的原理及要领。
2.
掌握滴定法的一般历程及操作技术
二、实验原理
维生素
c
又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料
2,6-
二氯酚靛酚钠盐，自己
则氧化成脱氢抗坏血酸。
2,6-
二氯酚靛酚在碱性溶液中呈深蓝色
,
被还原后变为
无色，在酸性介质中呈浅红色。因此可用蓝色的碱性染料
2,6-
二氯酚靛酚尺度
溶液滴定样品，对含维生素
C
的酸性浸出液进行氧化还原滴定
,
染料被还原为无
色
,
当到达滴定终点时
,
多余的染料在酸性介质中则体现为浅红色
,
由染料用量计
算样品中还原型抗坏血酸的含量。
三、实验试剂及器材
1. 实验试剂：
（
1
）
0.1% 2,6-
二氯酚靛酚
（
2
）
1%
、
2%
草酸溶液
（
3
）尺度抗坏血酸溶液（
0.2mgVc/ml
）
（
4
）样液
2. 实验器材：
碱式滴定管、铁架台、蝴蝶夹、锥形瓶、微量移液器、枪头等
四、实验步骤
1.
尺度滴定：
取尺度
Vc 1.0ml
（含
0.2
毫克抗坏血酸）与空锥形瓶中，加入
9.0ml 1%
草酸，
用
2,6-
二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持
15
秒稳定即为终点。用所用染料盘算
1ml
染料相当于几多毫克抗坏血酸。滴定开始时，染料要迅速加入，直到红色不
立即消失，才一滴一滴加入，并不停摇动锥形瓶，直至淡红色
15
秒不退。滴定
历程一般不凌驾
2
分钟。
2.
样液滴定：
取两份样液各
10ml
，划分放入
100ml
锥形瓶中，滴法同前，但不加草酸
盘算样品抗坏血酸含量。
五、实验结果与分析
1.
凭据尺度
V
C
的量及滴定所需的染料，盘算出每毫升染料可以滴定到少
V
C
2.
凭据待测样液滴定所需的染料体积盘算样液中
V
C
的含量
试分析测定的结果与实际是否相符，造成结果误差的原因有哪些？
六、实验注意事项
1.
注意滴定管的正确使用
首先加尺度溶液到
0
刻度以上
2-3ml
处，排净尖嘴内的气泡。然后调整液面
高度到
0
刻度或
0
刻度以下。
2.
滴液时先快后慢，接近所取体积时逐点滴入。
3.
读取刻度是目光平视刻度线，刻度线瞄准液体凹面。
七、思考题
1.
实验历程中，要测得准确的还原型维生素
C
值，实验历程中应注意哪些操作
步骤，为什么？
2.
在测定历程中，样品的草酸提取液为什么不能袒露在光下？
3.
试简述维生素
C
的生理意义。
实验五 从动物组织中提取脱氧核糖核酸
一、实验目的
1.
学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取
DNA
的原理和技术
2.
了解疏散提取
DNA
的一般原理。
二、实验原理
1.
动物细胞中的核糖核酸（
RNA
）与脱氧核糖核酸（
DNA
）与卵白结合形成核
卵白。划分体现为
RNP
和
DNP
。
RNP
和
DNP
在差异浓度氯化钠溶液中的溶
解度有显著差异。在
0.14M NaCl
中，
DNP
溶解度低，
RNP
溶解度高；在
1-2M
NaCl
溶液中，
DNP
溶解度高，
RNP
溶解度低。故调整
NaCl
溶液的浓度可将
RNP
和
DNP
从样本中逐步疏散出来。
2.
加变性剂
SDS
可使卵白质变性，与
DNA
疏散。 核酸自己带负电荷，结合正
电荷的卵白质，用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。去垢剂的作用：
1
）溶解膜卵白及脂肪，使细胞膜破裂；
2
）溶解核糖体上面的卵白质，使其解聚，将核酸释放出来；
3
）对
RNase
、
DNase
有一定的抑制作用。如：
SDS
、脱氧胆酸钠、
4-
氨基水杨
酸钠、萘
-1.5-
二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠
3.
用有机溶剂沉淀，去除卵白。本实验所用的有机溶剂为：氯仿
-
异丙醇混淆液
（
24:1
）； 氯仿：使卵白变性并加速有机相和水相的分层，增加核酸得率，同
时去除脂类。 异丙醇：淘汰泡沫，也能促使有机相和水相疏散。
4. DNA
不溶于乙醇等有机溶剂，因此可用乙醇沉淀法来纯化和浓缩
DNA
。
DNA
疏散提取的原则
1
）保证
DNA
结构的完整
2
）排除其他分子的污染
a.
核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子
b.
将其他生物大分子如卵白、脂类分子的污染应降到最低
c.
排除
RNA
的污染
三、实验试剂及器材
1.
试剂：
1
） 新鲜猪肝
2
）
0.14M NaCl-0.15M EDTA Na2
溶液
3
）
25% SDS
4
）
5M NaCl
5
）
氯仿
-
异丙醇混淆液
6
）
95%
乙醇
2.
器材：
离心机、恒温水浴箱、托盘天平、烧杯、玻棒、微量移液器等
四、实验步骤
1.
将猪肝用
0.14M Nacl-0.15M EDTANa2
溶液洗去血液，剪碎，置匀浆机中研
磨成糊状。
2.
取
50 mL
猪肝糜离心
6min
，
3500rpm
。（离心机已经调整到位，直接操作即可）
3.
弃去上清液，剩余沉淀用
20mL 0.14M Nacl-0.15M EDTA
溶液洗涤，离心
6min
。
重复以上操作一遍。
目的是尽量除去
RNP
。所得沉淀为
DNP
粗品。
4.
向上述沉淀中加入
0.14M Nacl-0.15M EDTA
溶液，使总体积为
44mL
，然后
滴加
25% SDS
溶液约
3mL
（此步骤由老师把关），边加边搅拌。加毕，于
60℃
水浴保温
10min
，其间不停搅拌，取出冷却至室温。
目的是使核酸与卵白质分
离。
5.
加入
5M Nacl
溶液
10mL
，此时
Nacl
的浓度正好为
1M
，
DNA
的溶解度是水
中的两倍，搅拌
10min
，加入约一倍体积的氯仿
-
异丙醇（
40ml
足够）混淆液，
充实混匀，离心
6min
，
3500rpm
。
6.
取出离心管，内容物分为三层，上层为
DNA
溶液，中间是变性卵白质凝胶，
底部为有机相。小心取出上清液，置于烧杯中。
有机相接纳！
7.
由老师加入
1.5
倍体积
95%
冷乙醇，边加边轻挑，可视察到
DNA
丝状物缠
绕在玻棒上。
由老师打分。
五、实验注意事项（增补一下）
1.
各操作步骤要轻柔
,
尽量淘汰
DNA
的人为降解。
2.
取各上清时
,
不应贪多
,
以防非核酸类身分滋扰。
3.
异丙醇、乙醇等要预冷
,
以淘汰
DNA
的降解
,
促进
DNA
与卵白等的分相及
DNA
沉淀。
4.
提取
DNA
历程中所用到的试剂和器材要进行无核酸酶化处置惩罚。
5.
所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
实验六 核酸浓度测定——紫外吸收法
一、实验目的
1.
了解
Denovix
的基本原理并掌握其使用要领；
2.
掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和要领。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。
RNA
和
DNA
的
紫外吸收峰为
260nm
。一般在
260 nm
波长下，每毫升含
1mg DNA
溶液的光吸
收值约为
0.020
，每毫升含
1mgRNA
溶液的光吸收值为
0.022
。故测定待测浓度
RNA
或
DNA
溶液
260nm
的光吸收值即可盘算出其中核酸的含量。
卵白质由于含有芬芳氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常卵白质的吸收岑岭
在
280nm
处，在
260nm
处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中
卵白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
纯净的
RNA
溶液，其
A260/A280
≥
2
；纯净的
DNA
溶液，其
A260/A280
≥
1.8
。如果小于
1.8
或
2.0
，体现存在卵白质或酚类物质的影响。
A230
体现体现样
品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等。
Denovix
核酸卵白快速测定仪接纳一个可以发生多个波长的光源，通过系列
分光装置，从而发生特定波长的光源，光源透过待测试的样品后，部门被吸收，
盘算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
dsDNA
的消光系数为
50
，核酸的浓度
ng/ul=A260
╳
50
RNA
的消光系数为
40
ssDNA
的消光系数为
33
三、实验试剂及器材
（
1）
Denovix
核酸卵白分析仪（极微量）
（
2）微量移液枪、微量枪头、1.5ml 离心管、
ddH2O
、吸水纸、擦镜纸
四、实验步骤
1.
清洗样品台：
2μl
灭菌的
ddH2O
点在样品台上，放下悬臂，
10s
后抬起悬臂，
用洁净的无尘纸擦掉即可。
2.
使用溶解样品的缓冲液
1-1.5μl
点在样品台上，放下悬臂，点击
Blank
，测完
之后擦掉即可。
3.
混匀样品后，
1-1.5μl
点在样品台上，放下悬臂，点击
Measure
，泛起下图的
界面。
4.
丈量完样品后请实时擦掉样品。
五、实验结果
纪录核酸的浓度，并分析纯度
六、实验注意事项
1.
首次使用，请先清洁样品台。抬起悬臂，滴
1-2ul
灭菌蒸馏水于样品台上，
放下悬臂使上下界面接触，再用无尘纸或擦镜纸擦去上下外貌液滴。
2.
打开丈量应用，在样品台上滴加
1ul
溶解样品的
buffer
，注意视察液滴中
不能有气泡。
3.
丈量结束后，立即擦掉样品，防止样品干在样品台上，造成污染。
实验七 血清谷丙转氨酶的测定（King 氏法）
一、实验目的
1.
掌握血清谷丙转氨酶活力测定的原理和要领；
2.
进一步熟练尺度曲线的制作和分光光度计的使用。
二、实验原理
1.
生物机体内转氨基作用是
α
-
氨基酸的氨基通过酶促作用转移到
α
－酮酸的
酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反映。催化这反映的酶称为转
氨酶，其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的种种组织中，在肝、
心、肾等组织中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性较高。在正常的新陈代谢过
程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。
当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释
放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著升高。因此测定
这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。
2.
血清中的谷
-
丙转氨酶（
ALT
），在
37
℃、
pH7.4
的条件下，可催化基质（底
物）液中的丙氨酸与
α
-
酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
3.
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的
2,4
二硝基苯肼发生加成反映，生成
丙酮酸
-2,4-
二硝基苯腙，进而在碱性情况中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，
其颜色的深浅在一定规模内与丙酮酸的生成量，亦即与
ALT
活性的崎岖成正
比关系。据此与同样处置惩罚的丙酮酸尺度液相比力，便可算出或通过尺度曲线
查出血清中
ALT
的活性。
King
氏法谷丙转氨酶活性单元：每毫升血清在
37℃
与
pH7.4
的基质液
作用
60min
，生成
1μmol
丙酮酸为一个单元。临床检验取血清量为
0.1mL
，
陈诉数据以
100mL
血清盘算，因此实际测得结果乘
1000
即可。例如
0.1mL
丙酮酸尺度液中丙酮酸含量为
0.2μmol
，即相当
GPT200U/100mL
。
三、实验试剂及器材
1.
试剂：
1
）
pH7.4
磷酸缓冲溶液
2
）
L-
丙氨酸和
α
-
酮戊二酸混淆液
3
）丙酮酸尺度液
4
）
2
，
4 -
二硝基苯肼溶液
5
）
0.4mol/L NaOH
溶液
2.
器材：
722
分光光度计、微量移液器、枪头、恒温水浴锅、试管、试管架等
四、实验步骤
1.
取
4
支干燥试管，按下表加入试剂：
管号
血 清
（
mL
）
基质液
（
mL
）
尺度丙酮酸
（
mL
）
磷酸缓冲液
（
mL
）
1
（空白管）
0.6
2
（对照管）
0.1
0.5
3
（尺度管）
0.5
0.1
4
（样品管）
0.1
0.5
2.
加毕摇匀，置
37
℃水浴中保温
30
分钟，取出冷却至室温。各加
0.5mL 2,4 -
二硝基苯肼溶液，准确作用
5
分钟。各加
0.4mol/L NaOH
溶液
5mL
，摇匀，
10
分钟后比色。以
1
号管调零，测
2
、
3
、
4
号管
A530
，按下式盘算丙酮酸生
成量（注意单元）：
五、实验注意事项
1.
为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验历程所用的一切器皿（注
射器、试管等）应清洗洁净，干燥后方能使用。
2.
为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定
pH
，保温时间，选用牢固的比色
计，比色杯以淘汰误差。
3.
吸量准确，严格控制反映时间和温度。
实验八 基于口腔拭子 PCR 基因组 DNA 扩增实验
一、 实验目的
1.
了解
PCR
基因扩增的一般原理
2.
掌握
PCR
基因扩增操作技术
二、 实验原理
PCR
（
Polymerase Chain Reaction
）是聚合酶链式反映的简称，指在引物指导下由
酶催化的对特定模板
(
克隆或基因组
DNA)
的扩增反映，是模拟体内
DNA
复制
历程，在体外特异性扩增
DNA
片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应
用，包罗用于
DNA
作图、
DNA
测序、分子系统遗传学等。
1. PCR
扩增的基本特征及要素如下：
（
1
）
PCR
技术的基本原理类似于
DNA
的天然复制历程
（
2
）是以单链
DNA
为模板，
4
种
dNTP
为底物，在模板
3'
未端有引
物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次重复的循环能使微量
的模板
DNA
获得极洪流平的扩增。
（
3
）
PCR
反映需要在一定的条件下才气完成，只有这些条件协调作
用时才气到达很好的效果
: (1)
缓冲液
; (2)
脱氧三磷酸核苷
(dNTP) ;(3)
引物
;(4)
模板
; (5) DNA
聚合酶。
2.
凭据
DNA
的半保留复制，以及
DNA
分子在体外差异的温度下双
链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反映系统的温度，使
双链
DNA
变性
(denature)
、退火
(annealing)
、延伸
(extension),
实现
DNA
的扩增。
（
1
）变性：模板
DNA
通过加热至
95
℃左右，使
DNA
双螺旋的氢键断裂，
形成单链
DNA,
作为反映的模板；
（
2
）退火：模板
DNA
经加热变性成单链后，温度降至引物的
Tm
值
左右或以下
(
比
Tm
低
5
°
C
，通常为
55~65
°
C)
，引物与模板
DNA
单链的互补序列配对结合；
（
3
）延伸：
DNA
模板
-
引物结合物在
DNA
聚合酶
(
一种耐热的
DNA
聚合酶
)
的作用下，于
70~74
℃下，以引物
3'
端为起始点按
5'
→
3'
偏向
使
DNA
新链延伸。
三、试验试剂及器材
1.
仪器：
（
1
）
PCR
仪
（
2
）移液枪、涡旋仪、离心机
2.
样品及试剂：
（
1
）样品：口腔拭子
（
2
）样本稀释液
（
3
）亚甲基四氢叶酸还原酶（
MTHFR
）
C677T
试剂盒
四、实验步骤
1.
口腔拭子样本收罗
（
1
）取样前
30
分钟，不要吃工具，吸烟，饮酒等。准备一杯清水，
饮入约
50ml
清水充实洗漱口腔约
10
秒，吐掉；
（
2
）重复上述步骤
2-3
次。取样推荐漱口后半个小时 。
（
3
）撕开口腔拭子外包装，小心取出口腔拭子（注意：整个取样过
程中手不能接触拭子部门）；
（
4
）用拭子刮拭脸颊内部
20-30
次，尽量制止接触牙齿跟舌头；
（
5
）将拭子伸入采样管，凭据差异型号的拭子接纳推入或折断采样头；
（
6
）旋转采样管，采样完成。
2.
样品的处置惩罚
（
1
）取拭子样本涡旋混匀
(30s
左右
)
，再以
1
：
2
吸取拭子样液与样
本稀释液涡旋混匀，反映
2
分钟后，作为模板进行
PCR
实验。
（
2
）
PCR
体系准备：
每人份需做两个反映，取两个
0.2ml PCR
管，在
PCR
管盖上标志
M
、
WT
；在标有
M
的管中加入
44μl M
扩增液，在标有
WT
的管中加入
44μl
WT
扩增液；划分向以上的
M
和
WT
管中个加入
1μl
反映液，盖紧管盖，涡旋混匀，离心待用；在标有
M
和
WT
的管中划分加入
5μl
待测样本
(
已用样本
稀释液处置惩罚过
)
，盖紧管盖，涡旋混匀，瞬时离心。
3. PCR
扩增
将
PCR
管放入
PCR
仪中，按如下法式扩增：
50
℃
2 min
；
95
℃
3min30sec
；
94
℃
5sec
、
60
℃
10sec
、
65
℃
30sec
（
31Cycles
）；
65
℃
10min
；
4
℃
Hold
。
取出
PCR
产物，
2~8
℃生存。
五、结果分析
1.
从密封袋中取出检测卡，将待测样本
M
与
WT
管中的
PCR
产物（用
手动或者自动化加样平台）滴加在检测卡对应的样品垫处，待
2~5 min
对结果
进行判读，
20min
后结果不行靠。
2.
将待测样本
M
与
WT
管中的
PCR
产物划分滴加在检测卡对应的样品垫
上，凭据在检测线（
T
线）是否泛起条带判读
C677T
位点的基因型。若
M
管
产物在试纸条上
T
线处不泛起条带而
WT
管产物泛起条带，则为野生型
（
677CC
型）；反之则为纯合突变型（
677TT
型），若两管产物均在试纸条
T
线
处泛起条带则判读为杂合突变型（
677CT
型）；无效判定：质控线（
C
线）不
泛起条带，可能为操作不正确或试纸条已变质损坏。
六、注意事项
实验室应该遵循
PCR
实验规范的要求分区操作，各区物品均为专用，不得
交织使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加样后均需更换吸头。
1
．隔离差异操作区
;
2
．分装试剂
;
3
．严格实验操作
;
4
．严格按无菌操作的原则进行
PCR
所有操作等。
七、思考题
1.
循环次数是否越多越好
?
为何？
2.
如何凭据实验结果优化
PCR
体系？
下学期实验：
实验一 核酸浓度测定——定磷法
一、实验目的
1.
掌握定磷法测定核酸含量的原理和要领
2.
熟练掌握分光光度计的使用要领
二、实验原理
1.
核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为
9.2%
左右
(RNA
含磷量约
9.0%
，
DNA
含磷量约为
9.2%)
，若测得某一核酸样品中有机磷的含量，即可推算其
核酸的含量。
2.
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
3.
酸性情况中，无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
PO
4 3-
+ 3NH
4 +
+ 12MoO
4 2-
+ 24H
+
(NH
4
)
3
PO
4
·
12MoO
3
·
6H
2
O
↓
(
黄
色
)+6H
2
O
4.
当有还原剂存在时，
Mo
6+
被还原成
Mo
4+
，此
4
价钼再与试剂中的其它
MoO
4 2
－
结合成
Mo(MoO
4
)
2
或
Mo
3
O
8
呈兰色，称为钼兰。
钼兰在一定浓度规模内
(
无
机磷含量在
1
—
25
μ
g),
兰色的深浅和磷酸的含量成正比
,
可用比色法测定其
光吸收值。
(NH
4
)
3
PO
4
·
12MoO
3
·
6H
2
O +
还原剂（抗坏血酸）
钼兰
Mo(MoO
4
)
2
或
Mo
2
O
8
三、实验试剂及器材
1.
试剂：
1
） 硫酸
2
）尺度磷溶液（
20
微克磷
/
毫升）、
3
）定磷试剂（在使用前将上述试剂按以下比例混淆
,
蒸馏水
:17% H
2
SO
4
:
2.5%
钼酸铵
: 10%
抗坏血酸
= 2
：
1
：
1
：
1
（
V/V
））
4
）样液
2.
器材：
通风橱、消化仪、容量瓶、移液器、试管、
722
分光光度计等
四、实验步骤
1.
磷尺度曲线的绘制：取
6
只试管，按下表加入试剂
管号
尺度磷溶液
(mL)
去离子水
(mL)
定磷试剂
(mL)
1
0
3
3
2
0.2
2.8
3
3
0.4
2.6
3
4
0.6
2.4
3
5
0.8
2.2
3
6
1
2
3
7
总磷
3mL
0
3
8
无机磷
3mL
0
3
加毕摇匀，于
45℃
水浴中保温
10
分钟（注意保温时间相同），冷却，测
A660
，
以磷含量为横坐标，
A660
为纵坐标作图。
2.
总磷的测定：
取样液
1.0 mL
于克氏烧瓶中，加入
2.5mL 27% H2SO4 ,
烧瓶口放一小漏斗，
于通风橱中加热消化，浓烟散尽溶液基本无色透明即体现消化完成。冷却，将消
化液移至
100mL
容量瓶中，用少量去离子水冲洗烧瓶两次，洗涤液一并倒入容
量瓶，定容，摇匀后取
3.0mL
置于
7
号试管中，加入定磷试剂
3.0mL
，摇匀，
45℃
水浴保温
10
分钟，测
A660
。
3.
无机磷的测定：
取样液
1.0mL
于
100mL
容量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀后取
3.0mL
置
于
8
号试管中，加入
3mL
定磷试剂，摇匀，
45℃
水浴保温
10
分钟，测
A660
。
4.
盘算：
有机磷
=
总磷
-
无机磷
由尺度曲线查得有机磷微克数（
X
）
,
按下式盘算样品中核酸百分含量。
样品重量（
2000
微克）
五、实验注意事项
1.
消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样。
2. 1-8
号管
同时
加入定磷试剂后再放入
45
度水浴。
3.
分光光度计的使用：不用的时候要开着盖，注意比色皿毛面。
顺序为
1-4
；
1 5-7
；
1 8
。第一个不要动，用于调零。
4.
尺度曲线的绘制
:
获得
1-8
号管的吸光度后，写在实验陈诉表格的最右侧。进
里面的电脑，用
excel
拟合曲线，获得
R
方值，写在各人的实验陈诉纸上。要
求
R
方大于
0.995
，回去写实验陈诉时需要用坐标纸。
5.
废液盆里
只能
倒
1-8
号管中的溶液。枪头、擦镜纸扔在一次性杯子里。
6.
试剂及所有器皿清洁，不含磷；研究生检查试管内水珠不挂壁才气走。
实验二 胍盐-
β
巯基乙醇法提取 RNA
一、实验目的
1.掌握胍盐/?-巯基乙醇法提取 RNA 的原理和要领。
2.掌握第一链 cDNA 合成的原理和要领。
二、实验原理：
RNA 的提取要领：
1.异硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）
2.胍盐/?-巯基乙醇法
胍盐裂解样本，抑制 Rnase 的活性，
β
-巯基乙醇变性卵白，离心柱上用 DNA
和卵白酶消化基因组 DNA 和卵白，然后漂洗纯化的要领。
3.介质吸附法
RNA 的判定分析
纯度： OD260/OD280 <1.9—2.1 ,说明有 DNA 污染
OD260/OD280 = 1.9—2.1 ,说明纯度很好
OD260/OD280 > 1.9—2.1 ,说明有部门降解荧光光谱
第一链 cDNA 的合成：
以 RNA 为模板，反转录为 cDNA，由逆转录酶催化，该酶合成 DNA 时需要引
物引导，常用引物是 oligo dT、随机引物或基因特异引物（GSP）维生素 B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易剖析，
对热稳定。维生素 B2 溶液在 430～440 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧
光峰在 535 nm。维生素 B2 在 pH=6～7 的溶液中荧光强度最大，在 pH=11 的碱
性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素 B2 的含量。
三、试剂与仪器:
总 RNA 提取试剂盒（天根 RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit）；第一链 cDNA
合成试剂盒（Takara PrimeScript? RT Master Mix）；无菌，无ＲＮＡ酶离心
管无菌，无 RNA 酶枪头低温离心机等
四、实验操作:
1.提取总 RNA
1） 裂解细胞：确定细胞数量，吸除细胞培养基上清，加入 PBS 后吸除，加入
600ul 裂解液 RL（胍盐/?-巯基乙醇）5min。
2） 将所有溶液转移至过滤柱 CS 上(过滤柱 CS 放在收集管中)，12,000 rpm 离
心 2 min，收集滤液。
3） 向滤液中加入 1 倍体积 70%乙醇，混匀，获得的溶液和沉淀一起转入吸附柱
CR3 中， 12,000 rpm 离心 60 sec，倒掉收集管中的废液。
4） 向吸附柱 CR3 中加入 350
μ
l 去卵白液 RW1，12,000 rpm 离心 60 sec，倒掉
收集管中的废液，将吸附柱 CR3 放接纳集管中。
5） 向吸附柱 CR3 中央加入 80
μ
l 的 DNase I 事情液（10
μ
l DNase I 储存液
+70
μ
l RDD 溶液），室温放置 15 min。
6）向吸附柱 CR3 中加入 350
μ
l 去卵白液 RW1，12,000 rpm 离心 60 sec，倒掉
收集管中的废液，将吸附柱 CR3 放接纳集管中。
7）向吸附柱 CR3 中加入 500
μ
l 漂洗液 RW ，室温静置 2 min，12,000 rpm 离心
60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CR3 放接纳集管中。再重复一次。
8）12,000 rpm 离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱 CR3 置于室温放置 10 分钟，以
彻底晾干吸附质料中残余的漂洗液。
9）将吸附柱 CR3 转入一个新的 RNase-Free 离心管中，加入 30-100
μ
l
RNase-Free ddH2O 室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，获得 RNA 溶液。
10）RNA 判定分析（浓度，纯度）。2. 接纳 TaKaRa PrimeScript RT Master Mix 进行 cDNA 第一链合成：
1）按下列组分配制 RT 反映液
5X PrimeScrip Mix 2
μ
l
Total RNA (50
μ
M) -- ul
RNase free H2O up to 10
μ
l
2）反转录反映条件如下
37℃ 15min （反转录反映）
85℃ 5sec （反转录酶失活反映）
五、实验注意事项
1. 严格控制外源性 RNA 酶的污染：外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾
液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人
员的手及种种试剂的污染。
2. 最大限度地抑制内源性的 RNA 酶：而种种组织和细胞中则含有大量内源性的
RNA 酶。
3. 戴手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染。
4. 使用无 RNase 的塑料制品和枪头制止交织污染。
5. RNA 在裂解液 RL 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处置惩罚历程中应使用不
含 RNase 的塑料和玻璃器皿。
6. 配制溶液应使用无 RNase 的水。
实验三 real-time PCR 测端粒酶 mRNA 表达
一、实验目的
1.掌握 RT-PCR 基因扩增的原理和历程
2.了解端粒酶的结构与功效
二、实验原理：
1. 实时定量 PCR 技术：
利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反映中每一个循环扩增产物量的变化，
通过 Ct 值和尺度曲线的关系对起始模板进行定量分析。
Ct 值的界说：PCR 扩增历程中，扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Xn = X0 × （
1＋En）Ct
lg Xt ＝lg X0 ＋ Ct lg（
1＋En）
Ct = -k lg X0 ＋ b
X0 ：起始模板数量
En：扩增效率
Xt：荧光扩增信号到达阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数
Log 模板起始浓度与 Ct 值呈线性关系。
模板 DNA 量越多，荧光到达阈值的循环数越少，即 Ct 值越小。
2.常用荧光标志要领：
特异性荧光标志 TaqMan Probe
非特异性荧光标志 SYBR Green I：是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域
的具有绿色引发波长的染料。
问题点：
SYBR Green I 与双链 DNA 进行结合后散发荧光，因此如果反映体系
中有非特异性扩增或引物二聚体的发生，也将同时被检测，从而可能导致检测
结果禁绝确。
要害点：
设计合适引物，防止非特异性扩增！
端粒酶：通过识别并结合富含胞嘧啶 C 的端粒末端，以自身 RNA 为模板， TER
催化，合成端粒的 DNA 重复序列，从而阻止随着 DNA 复制和细胞破裂所
造成的端粒的不停缩短， 进而稳定染色体的长度，制止细胞因端粒丢失
所导致的凋亡。因此，端粒酶在细胞永生化和肿瘤发生中起着重要作用。
相对定量分析——2 -
? ?
Ct 法
三、试剂与仪器:
1. LightCycler 480 SYBR Green I Master
2. LightCycler 8-Tube Strips (white)
3. 无菌，无ＲＮＡ酶离心管
4. 无菌，无ＲＮＡ酶枪头
四、实验操作:
1. 加样：试剂 体积
模板（稀释 5 倍） 2?l
Master mix，2×conc. 10?l
正向引物 1?l
反向引物 1?l
水，PCR 级别 6?l
总体积 20?l
2.PCR 法式设定：SYBR Green I 选择“SYBR Green I /HRM Dye”，反映总体积
20 ul。
3.设定每个法式中对应步骤的①温度(Target)、②信号获取模式(Acquisition
Mode)及 ③时间(Hold)。
4.设定完成后，放入样板，窗口右下方的“Start Run” 按钮将由灰色变为蓝色，
此时即可点击之，开始运行实验。
5.运行完毕后，点击界面左侧“Sample Editor”，对样本详细信息进行编辑。
6.点击界面左边的“Analysis”，进入分析界面，进行 Tm 分析 (Tm Calling) 分
析和相对定量 (Relative Quantification) 分析
五、结果分析
2 - △△Ct 法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近 100%
△Ct（第 n 组）＝16－17＝-1 △Ct（第一组）＝18－17.4=0.6
△△Ct=△Ct（第 n 组）－△Ct（第一组）＝-1－0.6＝－1.6
比率（癌细胞组/正常细胞组）=2－△△Ct＝2－（－1.6） = 3
所以 TERT 基因在癌细胞的表达水平是正常细胞的 3 倍。
要求实验陈诉分析出自己组对比第一组的结果
六、实验注意事项
1、能尺度的使用微量移液器，使重复样本获得相同的结果。2、学会分析溶解曲线，获得循环 CT 值后学会如何分析结果。
实验四 卵白分子量测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验目的
1.
学习
SDS-PAGE
测定卵白质分子量的基本原理
2.
掌握
SDS-PAGE
垂直板电泳的操作要领
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶（
PAGE
）是由丙烯酰胺（
Acr
）和交联试剂
N,N
’
-
甲叉双丙
烯酰胺
(Bis)
在有引发剂（如过硫酸铵）和增速剂（如
N,N,N
’
,N
’
-
四甲基乙二胺，
TEMED
）的情况下聚合而成的。在一定浓度规模内，改变聚合体系中
Acr
和
Bis
的比例，可获得差异网眼巨细的凝胶，由于凝胶的三维网状结构，对在凝胶中泳
动的差异分子量的质点有着选择和阻碍，因此具有分子筛效应，决定着聚丙烯酰
胺凝胶的有效疏散笵围。
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进了十二烷基硫酸
钠（
sodium dodecyl sulfate
，简称
SDS
），
SDS
是一种阴离子去污剂，它能破坏
卵白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使卵白质变性而改变原有
的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于卵白质分子内的二硫
键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了卵白质分子与
SDS
充实结合，形成
带负电荷的
SDS-
卵白质复合物。
带负电荷的卵白质
-SDS
复合物由于结合了大量的
SDS
，使卵白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子巨细为特征的负离子团块，从而降低或消除
了种种卵白质分子之间天然的电荷差异。
卵白质
-SDS
复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。差异蛋
白质的
SDS
复合物的短轴长度都一样，约为
1.8nm
，而长轴则随卵白质的分子
量成正比变化。这样的卵白质
-SDS
复合物在凝胶中的迁移率，不再受卵白质原
有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是卵白质分子量的函数。
lgMw = -bRm + K
Mw
：卵白质的分子量；
Rm
：相对迁移率
b
： 斜率
;
K
：截距
当条件一定时，
b
，
K
均为常数，即此时
lgMw
与
Rm
的关系为线性关系，
如以
lgMw
对
mR
作图，应获得一条直线，如上图。
若将已知分子量的尺度卵白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标
准曲线。未知卵白质的相同条件下进行电泳，凭据它的电泳迁移率即可在尺度曲
线上求得分子量。
三、实验试剂及仪器
1.
实验试剂
（
1
）
30%
丙烯酰胺（
Acr
）：
Acr/
甲叉双丙烯酰胺
(Bis)=29:1
（
2
）
10%SDS
（十二烷基磺酸钠）
（
3
）
10%
过硫酸铵
(AP)
（
4
）
TEMED
（四甲基乙二胺）
（
5
）
2
×上样缓冲液：
10%SDS
（
4ml
）
+
巯基乙醇（
1ml
）
+0.2%
溴酚蓝（
2ml +
甘油
2ml +1M pH6.8Tris-HCl
（
1ml
）
（
6
） 浓缩胶缓冲液（
1M Tris-Cl
缓冲液
pH6.8
）
（
7
） 疏散胶缓冲液（
1.5M Tris-Cl
缓冲液
pH8.8
）
（
8
） 电泳缓冲液
: (SDS 20g
，
Tris 60g,
甘氨酸
282.2g, pH8.3
）加蒸馏水使其溶
解后定容至
2L
。
（
9
） 牢固液：乙醇
500ml
，冰乙酸
100ml
混匀，
（
10
） 染色液：考马斯亮蓝
R250 1.25g
，甲醇
225ml
，冰乙酸
50ml
，蒸馏水定
溶至
1L
。
（
11
） 脱色液：冰乙酸
80ml
，乙醇
250ml
，加蒸馏水定容至
1L
。
2.
实验仪器
（
1
）垂直板电泳装置、电泳仪、制胶架
（
2
）移液枪、移液管
（
3
） 烧杯、培养皿
（
4
） 离心机
四、实验步骤
1.
装板
将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入
凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，
把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂
直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。
2.
疏散胶的配制（
12%
）
试剂
体积
H2O
3.35
（
ml
）
凝胶贮备液
2.5
（
ml
）
疏散胶缓冲液
(pH8.8)
2.5
（
ml
）
10% SDS
0.1
（
ml
）
TEMED
5
（
ul
）
10%
过硫酸铵
50
（
ul
）
总体积
10
（
ml
）
3.
疏散胶的灌注和聚合
用移液管将所配制的疏散胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面徐徐注
入，留出梳齿的齿高加
1cm
的空间以便灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待疏散胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。
4.
浓缩胶的配制（
5%
）
试剂
体积
H2O
2.92
（
ml
）
凝胶贮备液
0.8
（
ml
）
疏散胶缓冲液
(pH6.8)
1.25
（
ml
）
10% SDS
0.05
（
ml
）
TEMED
5
（
ul
）
10%
过硫酸铵
25
（
ul
）
总体积
5.05
（
ml
）
5.
浓缩胶的灌注和聚合
用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面徐徐
加入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。
6.
样品的准备
在低分子量尺度卵白质和待测样品中划分加入适量还原缓冲液，放入滚水
中加热
3-5min
，取出冷至室温。
7.
加样
加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加
入
Marker
。
8.
电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电压控制在不高于
100V
，
电流恒定在
10mA
；样品进入疏散胶后，电压控制在不高于
140V
，电流恒定在
20mA
。待指示剂染料（溴酚蓝）迁移至凝胶下沿
1.0cm
处停止电泳。
9.
染色和脱色
电泳结束后，撬开玻璃板， 小心将胶取出，放入一大培养皿中。
染色：加入染色液，置于摇床上染色
2h
。
脱色：染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换
一次脱色液，直至配景清晰，拍照。
10.
相对分子质量的盘算
量出疏散胶顶端距溴酚蓝间的距离
(cm)
以及各卵白质样品区带中心与疏散
胶顶端的距离
(cm)
，按下式盘算相对迁移率
:
卵白质样品距疏散胶顶端迁移距离
(cm)
Rm =
溴酚蓝区带中心距疏散胶顶端距离
(cm)
以尺度卵白质分子量的对数对相对迁移率作图，获得尺度曲线，凭据待测样
品相对迁移率，从尺度曲线上盘算出其分子量。
五
、
实验结果与分析
1.
凭据凝胶结果，依据尺度卵白条带，判断各个卵白质样品区带或许分子量。
2.
丈量样品中种种卵白质分子的相对迁移率
Rm
值，然后凭据尺度曲线盘算
出各自精确分子量
3.
对实验操作及结果中不足之处进行分析。
六、实验注意事项
1
．丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免
避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。
2
．
10%
过硫酸铵必须现用现配，
4
℃冰箱贮存不凌驾
48
小时。
3
．灌制凝胶时，应制止发生汽泡，因为汽泡会影响电泳疏散效果。
4.
卵白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰
;
加样量太多则泳道超载，条带
过宽而重叠，甚至笼罩至相邻泳道。
5
．刚灌注疏散胶混淆溶液后，应在疏散胶液面上加
1-2cm
高的水层，以阻隔空
气。胶液面上加水层时要特别小心，徐徐叠加，以免冲坏凝胶的胶面。
七、思考题
1.
在不连续体系
SDS-PAGE
中，当疏散胶加完后，需在其上加一层水，为什么
?
2.
电极缓冲液中甘氨酸的作用
?
3.
在不连续体系
SDS-PAGE
中，疏散胶与浓缩胶中均含有
TEMED
和
AP
，试述
其作用
?
4.
样品液为何在加样前需在滚水中加热几分钟
?
实验五 糖酵解中间产物的判定
一、实验目的
1
．掌握糖酵解中间产物的判定要领和原理。
2
．熟悉通过酶的抑制作用调治代谢途径。
3
．了解使中间产物聚集的要领在研究中间代谢中的意义。
二、 实验原理
在细胞质中，一分子葡萄糖通过一系列反映转化为两分子丙酮酸，并陪同着
ATP
生成的一系列反映是有机体获得化学能的最原始的途径，也是原核生物和真
核生物糖类物质剖析代谢的配合途径。利用碘乙酸对糖酵解历程中的
3-
磷酸甘油
醛脱氢酶特异地且不行逆地抑制作用，使
3-
磷酸甘油醛不再向前变化而积累。硫
酸肼作为稳定剂，用来掩护
3-
磷酸苷油醛使其不自发剖析。然后用
2,4-
二硝基苯
肼与
3-
磷酸甘油醛在碱性条件下形成
2,4-
二硝基苯肼
-
丙糖的棕色复合物，其棕
色水平与
3-
磷酸甘油醛含量成正比。从而证明糖的剖析代谢历程中，含有
3-
磷
酸甘油醛的中间产物。
三、实验试剂及器材
1.实验质料
新鲜酵母
2. 仪器：
离心管、移液枪；恒温水浴；离心机
3.试剂：
1
）
2,4-
二硝基苯肼
: 0.1 g 2,4-
二硝基苯肼溶于水
100 ml 2 mol/L
盐酸溶液中，储
于棕色瓶中备用。
2
）
0.56 mol/L
硫酸肼溶液
:
称取
7.28 g
硫酸肼溶于
50 ml
水中，这时不会全部溶
解，当加入
NaOH
使
pH
值达
7.4
时则完全溶解。
3
）
5%
葡萄糖溶液。
4
）
10%
三氯乙酸溶液。
5
）
75 mol/L NaOH
溶液。
6
）
0.002 mol/L
碘乙酸溶液。
四、实验步骤
1．取小烧杯 3 支，编号，划分加入新鲜酵母 0.3 g，并按表 1 划分加入各试剂，
混匀。
2．将各杯混淆物划分放入 37℃水浴中保温 1.0 小时，视察发酵管发生气泡的量
有何差异。
3．在 2 号和 3 号杯中按表 2 补加各试剂，摇匀后放 5-10 分钟
4. 将三支离心管中的上清液划分进行离心或者过滤，3000rpm, 3min。
5．取 3 支试管，划分加入上述滤液 0.5 ml，并按表 3 加入试剂和处置惩罚。
（取上清液 0.5 ml，加入 0.75 mol/L NaOH 0.5 ml，混匀后在 37℃水浴保温
10 分钟，然后划分向上述试管中加入 0.5 ml 2,4-二硝基苯肼，混匀后在 37℃
水浴保温 10 分钟，然后加入 0.75 mol/L NaOH 3.5 ml，视察实验结果。）
表 1 糖酵解中间产物的判定——发酵发生气泡视察
编号
5%
葡萄糖溶
液 （
ml
）
10%
三氯乙
酸（
ml
）
碘乙酸
（
ml
）
硫酸肼
（
ml
）
发泡量
1
10
（
ml
）
2
1
1
2
10
（
ml
）
0
1
1
3
10
（
ml
）
0
0
0
表 2
补加试剂
编号
10%
三氯乙酸
（
ml
）
碘乙酸
（
ml
）
硫酸肼
（
ml
）
发泡量
2
2
0
0
3
2
1
1
表 3 糖酵解中间产物的判定——二硝基苯肼反映
五、结果与分析
实验中哪一发酵管生成的气泡最多?哪一管最后生成的颜色最深? 为什么?
描述视察到得实验现象并对实验结果加以分析。包罗保温后的气泡量及最后的
显色效果。
六、注意事项
1. 本实验虽为定性判定，但量取体积等人要求相瞄准确 ；
2. 注意试剂的添加顺序，编号不要弄混 ；
3. 每步反映前注意要充实混匀 。
七、思考与讨论
1. 实验判定的是哪种中间产物？
2. 实验中三氯乙酸、碘乙酸、硫酸肼三种试剂划分起什么作用？
3. 实验中的气泡是什么气体? 如何发生的？
编号
滤液
（ml）
0.75 mol/L
NaOH（ml）
摇
匀
，
室
温
放
置
5
分
钟
2，4-二硝基
苯肼 （ml）
摇
匀
，
室
温
放
置
5
分
钟
0.75 mol/L
NaOH（ml）
1
0.5
0.5
0.5
3.5
2
0.5
0.5
0.5
3.5
3
0.5
0.5
0.5
3.5
实验六 荧光分光光度法测定维生素 B2 的含量
一、实验目的
1．学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素 B2 的分析原理；
2．掌握荧光分光光度计的使用要领；
3．了解分子荧光发生的机理.
二、 实验原理
维生素 B2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光
照易剖析，对热稳定。 维生素 B2 在碱性溶液中经光线照射会发生剖析而转化为
光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测 VB2 的荧光时溶液要控制在
酸性规模内，且在避光条件下进行。
核黄素
(V
B2
)
光黄素
多维葡萄糖中含有维生素 B1、B2、C、D2 及葡萄糖，其中维生素 C 和葡萄糖
在水溶液中不发荧光，维生素 B1 自己无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后
才发生荧光，维生素 D2 用二氯乙酸处置惩罚后才有荧光，他们都不滋扰维生素 B2
的测定。
维生素 B2 溶液在 430～440 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为
545 nm。VB2 的荧光在 pH=6～7 时最强，在 pH=11 时消失。
三、实验试剂及器材
1. 试剂：
100
μ
g/mlVB2 尺度溶液（4%冰醋酸配制，置阴暗处生存）；冰乙酸；
多维葡萄糖粉试样
2. 器材：
岛津 RF5301PC 荧光分光光度计 ；微量移液器 ；容量瓶；石英比色皿
四、实验步骤
1、打开氙灯，再打开主机，然后打开盘算机启动事情站并初始化仪器。
2、仪器初始化完毕后，在事情界面上选择丈量项目
设置适当的仪器参数：引发波长 Ex= 435 nm，发射波长 Em=545nm。
3、尺度曲线测定，样品测定。
4、制作尺度曲线，由尺度曲线盘算样品中维生素 B2 的含量。
5、 退出主法式，关闭盘算机，先关主机，最后关氙灯。
五、结果与分析
1、 原始数据:尺度曲线以及样本的荧光值。
丈量 1-6 号尺度曲线荧光值：VB2 的含量：0.0ug/ml、0.1ug/ml、0.2ug/ml、
0.3ug/ml、0.4ug/ml、0.5ug/ml。
丈量 7 号样品荧光值
2、绘制出尺度曲线：要求规范作图
铅笔作图；
横、纵坐标名称及单元；
日期、作者 、曲线名称；
曲线上体现出待测样品的荧光值及浓度值。
3、盘算：样品中维生素 B2 的量。
要求： 写出公式、代入数据、写出结果。
实验八 pH 值和温度对酶促反映速度的影响
一、实验目的
1
．了解差异
pH
和温度对淀粉水解和唾液淀粉酶活性的影响。
2
．学会测定酶最适
pH
和温度的要领。
二、实验原理
酶都是卵白质，它的活性受情况 pH 的影响极为显著。通常种种酶只有在一
定的 pH 规模内才体现它的活性，一种酶体现其最高活性时 pH 的值，称为该酶的最适 pH。本实验以唾液淀粉酶在差异的温度和 pH 下对淀粉的作用为例视察温度
和 pH 对酶活性的影响，淀粉的水解水平用其与碘液的呈色反映加以区别。
三、实验试剂及器材
1. 试剂：
淀粉；碘；碘化钾；磷酸氢二钠；柠檬酸
2. 器材：
试管 吸量管 试管架 吸耳球
四、实验步骤
1. 溶液配制：
0.5%淀粉溶液（含 0.3%氯化钠）（新鲜配置），碘-碘化钾溶液（4 g 碘及碘化
钾 6 g 溶于 100 ml 蒸馏水中，于棕色瓶中生存），0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液，
0.1 mol/L 柠檬酸溶液。
2. 样品收集
每人取一个洁净的小烧杯，先用自来水漱口，将口腔内的食物残渣清除洁净，
然后去蒸馏水约 20ml 含入口中，做咀嚼行动 3-4min,以排泄较多的唾液。将
口腔中的蒸馏水吐入洁净的小烧杯中，此即为稀释的唾液淀粉酶液。
3. pH 对酶活性的影响
（
1）缓冲液的配制
编号
0.2mol/L
磷酸氢二纳（
ml
）
0.1mol/L
柠檬酸（
ml
）
缓冲液（
ml
）
1
5.15
4.85
5.0
2
6.16
3.39
6.2
3
7.72
2.28
6.8
4
9.08
0.92
7.4
5
9.72
0.28
8.0
（
2）底物的准备
6 支干燥的试管编号，依次加入差异 pH 的缓冲液各 3 ml，第 6 号试管与第
3 号相同。再向每个试管中添加 0.5%淀粉溶液 2 ml，摇匀。
（
3）酶促反映时间测定
向第 6 号试管加入稀释 100 倍的唾液 2 ml，摇匀后放入 37 ℃恒温水浴中保
温。每分钟取 1 滴混淆液于离心管中或反映板上，加 1 滴碘化钾-碘溶液，呈橙
黄色时取出试管，纪录时间。
（
4）最适 pH 测定
以 1 min 的间隔，依次向 1～5 号试管中加入稀释 200 倍的唾液 2 ml，摇匀，
同样以 1 min 间隔，将 5 只试管放入 37 ℃恒温水浴中保温，反映至所需时间。
依次取出，立即加入碘化钾-碘液 2 滴，充实摇匀。视察颜色，可看出差异 pH
值时淀粉被水解的水平，差异 pH 值对唾液淀粉酶活性的影响，并确定其最适 pH。
4. 温度对酶活性的影响
(1）取三支试管按下表操作：
试剂
管号
1
2
3
1%
淀粉溶液（
ml
）
1
1
1
放置条件
滚水浴
37
℃
冰浴
稀释唾液（滴）
4
4
4
划分按上述条件继续放置 10 min。
(2) 从三支试管中取出溶液 1 滴于离心管中或反映板上，加上 1 滴碘液，视察呈
色现象，纪录结果并解释其原因。
五、注意事项
1. 各管反映及操作应保证在同一水平；
2. 每管间隔相同的时间加样和终止反映以保证各管反映时间相同。
附件：生化实验.pdf
